Sắc ký pha đảo

Phân tách dựa trên phân cực

HPLC pha thuận:

Sắc ký pha thuận được thiết lập trên sự cân bằng phân vùng giữa pha tĩnh phân cực và pha động không phân cực.

Độ phân cực của pha tĩnh cao hơn pha động. Quá trình lưu giữ nói rằng đầu tiên càng ít phân cực, và sau đó là các chất tan tăng độ phân cực.

Nói chung, silica bao gồm giai đoạn tĩnh trong khi giai đoạn động thường bao gồm hexan, cloroform, isopropanol, v.v.

Công dụng: NPLC nhận thấy cách sử dụng của nó trong quá trình phân tách, đặc biệt là trong các điều kiện mà khả năng hòa tan trong nước của hợp chất mẫu bị hạn chế. Nó cũng thích hợp để tách nhiều loại đồng phân và các hợp chất khác nhau về số lượng hoặc đặc tính của các nhóm chức.

HPLC pha đảo

Sắc ký pha đảo được thiết lập trên sự cân bằng phân vùng giữa pha tĩnh không phân cực (kỵ nước) và pha động có cực, trong đó độ phân cực của pha động cao hơn pha tĩnh.

Không giống như NPC, nhiều chất tan phân cực hơn được rửa giải trước và sau đó là các chất tan giảm độ phân cực.

Nguyên tắc sắc ký pha đảo khẳng định rằng sự phân tách trong sắc ký pha đảo dựa trên sự hấp phụ/giải hấp phụ thuận nghịch của các phân tử chất tan với mức độ kỵ nước thay đổi thành pha tĩnh kỵ nước. Hầu hết các thí nghiệm phân tách pha đảo ngược được thực hiện qua một số bước cơ bản.

Sắc ký pha đảo

Hình: Nguyên tắc của sắc ký pha đảo với rửa giải gradient. (Hình ảnh sửa đổi: Tham khảo – 2)

[LƯU Ý: Trong trường hợp phân tử sinh học, sắc ký pha đảo ngược chủ yếu sử dụng rửa giải gradient hơn là rửa giải đẳng dòng.

Rửa giải đẳng dòng là sự tách trong đó thành phần pha động không đổi trong suốt quy trình trong khi rửa giải Gradient hoàn toàn ngược lại khi thành phần pha động bị thay đổi trong quá trình tách.
Rửa giải đẳng cấp thích hợp nhất cho các phép phân tách đơn giản và rửa giải gradient thích hợp để phân tích các mẫu phức tạp.]

Ví dụ về pha động là hỗn hợp nước hoặc đệm (dung môi nước) và dung môi hữu cơ như metanol, axetonitril hoặc tetrahydrofuran (THF).

Sử dụng: Khoảng 80% các ứng dụng HPLC được bao phủ bởi RPLC. Nó được sử dụng để tách hỗn hợp bao gồm các thành phần khác nhau về trọng lượng phân tử và / hoặc khả năng hòa tan trong nước.

Kiểu phân tách	Pha tĩnh	Pha động
Pha thuận	Phân cực	Không phân cực
Pha đảo	Không phân cực	Phân cực

Bảng: Đặc điểm pha cho sắc ký pha thường và pha đảo

Hydrophilic – Sắc ký tương tác (HILIC)

HILIC có thể được coi là một loại sắc ký pha thường mặc dù cơ chế phân tách được sử dụng trong phương pháp này phức tạp hơn NPLC.

HILIC có thể được sử dụng trong các chế độ rửa giải đẳng dòng hoặc gradient. Các hợp chất phân cực bị hút vào các hạt vật liệu đóng gói phân cực có thể được rửa giải khi độ phân cực của pha động tăng lên khi thêm nhiều nước (<20%). Quá trình rửa giải chất phân tích theo thứ tự tăng dần tính ưa nước. Để giữ các chất phân tích có thể ion hóa ở dạng đơn, chất đệm hoặc muối có thể được gắn vào pha động.

Sử dụng: Để phân tích các chất phân cực cao

Hydrophobic – Sắc ký tương tác (HIC)

Nó được coi là một loại sắc ký pha đảo ngược và dựa trên sự phân tách các phân tử theo tính kỵ nước của chúng. HIC có được lợi thế về sự cộng tác kỵ nước của các phân tử lớn với pha tĩnh kỵ nước vừa phải. Ví dụ: liên kết butyl [C4], chứ không phải là liên kết octadecyl [C18], silica.

Nguyên tắc tuân theo đối với sự hấp phụ protein vào môi trường HIC được coi là bổ sung cho sắc ký loại trừ kích thước và trao đổi ion.

Công dụng: Tách protein trong khi vẫn giữ nguyên hoạt tính sinh học có thể làm biến tính chúng.

Tách biệt dựa trên nạp điện tích

Sắc ký Ion – Trao đổi (IEC)

Chế độ phân tách này dựa trên điện tích, các ion mang điện tích trái dấu bị hút vào nhau trong khi các ion mang điện tích tương tự có thể đẩy nhau. Cơ sở của IEC là tương tác tĩnh điện giữa chất trao đổi ion và các chất hòa tan ion.

Pha tĩnh có tính axit hoặc bazơ mang điện tích âm hoặc dương trong khi pha động được tạo thành bởi chất lỏng phân cực như dung dịch muối trong nước. Sự phân tách xảy ra do lực ion hấp dẫn giữa các phân tử và pha tĩnh tích điện.

Nếu điện tích trên mẫu càng mạnh thì nó bị hút vào bề mặt ion càng mạnh và do đó, thời gian rửa giải sẽ mất nhiều thời gian hơn.

Công dụng: Tách các hợp chất ion / tích điện

Sự phân tách dựa trên kích thước:

Sắc ký loại trừ kích thước [SEC]

Việc tách các thành phần được thực hiện bằng pha tĩnh xốp (chẳng hạn như sự kết hợp của polysaccharid và silica) tùy theo kích thước của chúng.

Trong trường hợp này, các phân tử mẫu nhỏ xâm nhập hoàn toàn vào các lỗ xốp của pha tĩnh trong khi các phân tử lớn có thể xâm nhập một phần vào các lỗ xốp. Do đó, có thể dễ dàng truyền đạt rằng các phân tử lớn được rửa giải trước hơn các phân tử nhỏ của mẫu.

Công dụng: Tách các phân tử sinh học (protein và cacbohydrat), xác định trọng lượng phân tử hoặc sự phân bố phân tử của các đại phân tử và đánh giá chất lượng của các oligome, đồng thời, tách các polyme hòa tan trong nước.

Máy tạo nitơ cho máy sắc ký khí

Sắc ký trao đổi ion – Tổng quan

Phân loại sắc ký