Nguyên lý và ứng dụng Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)

Nguyên tắc, loại, thiết bị và ứng dụng của HPLC

• Sự khác biệt về tỷ lệ này gây ra sự phân tách nhiều thành phần. Việc phân tách sắc ký có thể được thực hiện bằng nhiều pha tĩnh, bao gồm silica cố định trên các tấm thủy tinh (sắc ký lớp mỏng), khí dễ bay hơi (sắc ký khí), giấy (sắc ký giấy) và chất lỏng (sắc ký lỏng).

Sắc ký lỏng cao áp

• Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) về cơ bản là một dạng sắc ký lỏng cột được cải tiến cao.
• Thay vì dung môi được phép nhỏ giọt qua một cột dưới trọng lực, nó bị ép qua áp suất cao lên tới 400 atm. Điều đó làm cho nó nhanh hơn nhiều.
• Tất cả các phân tách sắc ký, bao gồm HPLC hoạt động theo cùng một nguyên tắc cơ bản; tách một mẫu thành các bộ phận cấu thành của nó do sự khác biệt về ái lực tương đối của các phân tử khác nhau đối với pha động và pha tĩnh được sử dụng trong quá trình tách.

Phân loại

1. HPLC pha thông thường

• Phương pháp này phân tách các chất phân tích trên cơ sở phân cực. NP-HPLC sử dụng pha tĩnh phân cực và pha động không phân cực. Do đó, pha tĩnh thường là silica và các pha di động điển hình là hexane, methylene clorua, chloroform, dietyl ete và hỗn hợp các chất này.
• Do đó, các mẫu cực được giữ lại trên bề mặt cực của cột đóng gói lâu hơn các vật liệu ít cực hơn.

2. HPLC pha đảo

• Pha tĩnh là không cực (kỵ nước) trong tự nhiên, trong khi pha động là chất lỏng phân cực, chẳng hạn như hỗn hợp nước và metanol hoặc acetonitril. Nó hoạt động dựa trên nguyên tắc tương tác kỵ nước do đó vật liệu càng không phân cực thì nó sẽ được giữ lại càng lâu.

3. HPLC loại trừ kích thước

• Cột được lấp đầy bằng vật liệu có kích thước lỗ được kiểm soát chính xác và các hạt được phân tách theo kích thước phân tử của nó. Các phân tử lớn hơn nhanh chóng được rửa qua cột; các phân tử nhỏ hơn thâm nhập vào bên trong xốp của các hạt đóng gói và rửa giải sau đó.

4. HPLC trao đổi ion

• Pha tĩnh có bề mặt mang điện tích ion tích điện trái dấu với các ion mẫu. Kỹ thuật này được sử dụng gần như độc quyền với các mẫu ion hoặc ion hóa.
• Điện tích trên mẫu càng mạnh thì sẽ bị hút mạnh hơn vào bề mặt ion và do đó, sẽ mất nhiều thời gian hơn để rửa giải. Pha động là dung dịch đệm, trong đó cả pH và cường độ ion được sử dụng để kiểm soát thời gian rửa giải

Các thành phần chính của hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao

1. Dung môi

• Nội dung pha di động được chứa trong một resorvoir thủy tinh. Pha động, hoặc dung môi, trong HPLC thường là hỗn hợp các thành phần chất lỏng phân cực và không phân cực có nồng độ tương ứng thay đổi tùy thuộc vào thành phần của mẫu.

2. Bơm – Bộ phận phân phối dung môi

• Một máy bơm hút pha động từ resorvoir dung môi và buộc nó đi qua cột và bộ phát hiện hệ thống. Tùy thuộc vào một số yếu tố bao gồm kích thước cột, kích thước hạt của pha tĩnh, tốc độ dòng chảy và thành phần của pha động, áp suất vận hành lên tới 42000 kPa (khoảng 6000 psi) có thể được tạo ra.

3. Bộ tiêm mẫu 

• Người tiêm có thể là một mũi tiêm đơn hoặc một hệ thống tiêm tự động. Một kim phun cho hệ thống HPLC sẽ cung cấp việc tiêm mẫu chất lỏng trong phạm vi 0,1-100 mL thể tích với độ tái lập cao và dưới áp suất cao (lên đến 4000 psi).

4. Cột

• Cột thường được làm bằng thép không gỉ đánh bóng, dài từ 50 đến 300 mm và có đường kính trong từ 2 đến 5 mm. Chúng thường chứa đầy một pha đứng yên với kích thước hạt là 3 trận10.
• Các cột có đường kính trong nhỏ hơn 2 mm thường được gọi là cột microbore. Lý tưởng nhất là nhiệt độ của pha động và cột phải được giữ không đổi trong quá trình phân tích.

5. Đầu dò – Detector

• Máy dò HPLC, nằm ở cuối cột phát hiện các chất phân tích khi chúng rửa giải từ cột sắc ký. Các máy dò thường được sử dụng là máy quang phổ UV, huỳnh quang, máy quang phổ khối và máy điện hóa.

6. Thiết bị thu thập dữ liệu

• Tín hiệu từ máy dò có thể được thu thập trên máy ghi biểu đồ hoặc bộ tích hợp điện tử khác nhau về độ phức tạp và khả năng xử lý, lưu trữ và xử lý lại dữ liệu sắc ký. Máy tính tích hợp phản ứng của máy dò với từng thành phần và đặt nó vào máy sắc ký dễ đọc và diễn giải

Các ứng dụng của HPLC

• Thông tin có thể thu được bằng HPLC bao gồm độ phân giải, nhận dạng và định lượng của hợp chất. Nó cũng hỗ trợ trong việc tách hóa chất và tinh chế. Các ứng dụng khác của HPLC bao gồm:

Ứng dụng dược phẩm

1. Để kiểm soát sự ổn định của thuốc.
2. Nghiên cứu giải thể máy tính bảng của dạng bào chế dược phẩm.
3. Kiểm soát chất lượng dược phẩm.

 Ứng dụng môi trường

1. Phát hiện các hợp chất phenolic trong nước uống.
2. Theo dõi sinh học các chất ô nhiễm.

 Ứng dụng trong Pháp y

1. Định lượng thuốc trong mẫu sinh học
2. Xác định steroid trong máu, nước tiểu, vv
3. Phân tích pháp y về thuốc nhuộm dệt may.
4. Xác định cocaine và các loại thuốc lạm dụng khác trong máu, nước tiểu, v.v.

 Thức ăn và hương vị

1. Đo lường chất lượng nước giải khát và nước.
2. Phân tích đường trong nước ép trái cây.
3. Phân tích các hợp chất đa vòng trong rau.
4. Phân tích bảo quản

.

 Ứng dụng trong xét nghiệm lâm sàng

1. Phân tích nước tiểu, phân tích kháng sinh trong máu.
2. Phân tích bilirubin, biliverdin trong rối loạn gan.
3. Phát hiện Neuropeptide nội sinh trong dịch ngoại bào của não vv…