DM hàng có sẵn
Thiết bị chính
Thiết bị phụ trợ
Thiết bị Y tế
Phụ kiện
Dụng cụ
Hóa chất
Trang chủSự phát triển của Máy phân tích Axit amin
Tổng quan
Trong các chuyên mục trước, chúng tôi đã thảo luận về sự phát triển của sắc ký thẩm thấu gel đầu tiên (1) và công trình của Csaba Horváth tại Đại học Yale (New Haven, Connecticut) trong phòng thí nghiệm của Giáo sư S.R. Lipsky, dẫn đến sắc ký lỏng áp suất cao hiện đại đầu tiên (2). Tuy nhiên, mặc dù các thiết bị này thường được gọi là thiết bị sắc ký lỏng (LC) đầu tiên, nhưng thực tế chúng đã được tiền nhiệm bởi một thiết bị phức tạp khác dựa trên các nguyên tắc của LC trên nhựa trao đổi ion: máy phân tích axit amin tự động được phát triển vào năm 1958 tại Viện nghiên cứu y khoa Rockefeller (New York) bởi S. Moore, W.H. Stein và D.H. Spackman (3,4).
Hệ thống phân tích axit amin đã mở ra một lĩnh vực nghiên cứu hoàn toàn mới, cho phép làm sáng tỏ thành phần của protein. Chúng ta thậm chí có thể nói rằng sự phát triển nhanh chóng của ngành hóa sinh sẽ là điều không thể nếu không có nó. Tuy nhiên, vì phần lớn các nhà sắc ký không làm việc trong lĩnh vực sinh hóa, nên sự phát triển này tương đối xa lạ với công chúng. Trong phần này, chúng tôi cố gắng lấp đầy khoảng trống này trong lịch sử sắc ký.
Để hiểu được tầm quan trọng của sự phát triển này, một bản tóm tắt ngắn gọn về protein và axit amin, cũng như sự phát triển của phương pháp phân tách dựa trên trao đổi ion sẽ rất hữu ích.
Sản phẩm mới nhất!
Axit amin và protein
Axit amin là khối xây dựng của protein: polyme ba chiều rất phức tạp, chủ yếu là xoắn α, bao gồm hàng trăm axit amin được kết nối bằng liên kết peptide. Protein là hợp chất biểu hiện gen quan trọng trong các quá trình sống và điều này được phản ánh qua tên của chúng: “protein” bắt nguồn từ từ tiếng Hy Lạp proteios, có nghĩa là “có tầm quan trọng hàng đầu”. Thuật ngữ này lần đầu tiên được sử dụng vào năm 1839 bởi nhà hóa học vĩ đại người Thụy Điển JÖrs Jakob Berzelius (1770–1848). Nghiên cứu về axit amin có lịch sử lâu đời, dẫn đến việc nhận dạng chậm các axit amin riêng lẻ. Người đoạt giải Nobel năm 1902 Emil Fischer (1852–1919) đã chỉ ra vào đầu những năm 1900 cách các axit amin liên kết với nhau tạo thành polypeptide, khối xây dựng của protein (5).
Vào đầu thế kỷ XX, nghiên cứu về protein và axit amin được tiến hành theo hai hướng: như một phần của nghiên cứu dinh dưỡng và điều tra thành phần hóa học và thành phần của chúng. Nhiều thập kỷ làm việc chăm chỉ của nhiều nhà nghiên cứu đã xác định rằng protein của con người và động vật chứa 20 axit amin, trong đó 10 axit amin không thể được tổng hợp bởi cơ thể con người mà phải được hấp thụ qua đường dinh dưỡng. Lượng và sự cân bằng thích hợp của các axit amin thiết yếu trong chế độ ăn uống của chúng ta là rất quan trọng. Tuy nhiên, 20 axit amin tự nhiên này chỉ là một phần của các axit amin có trong tự nhiên: chúng ta biết về sự tồn tại của hàng trăm, thậm chí hàng nghìn axit amin khác.
Đương nhiên, các nhà nghiên cứu trong lĩnh vực sinh hóa, dinh dưỡng và các lĩnh vực khoa học sự sống khác muốn xác định từng loại axit amin có trong protein và xác định mức định lượng của chúng. Để làm được điều này, trước tiên, protein phải được thủy phân để phá vỡ các liên kết peptide. Điều này thường được thực hiện bằng cách đun sôi peptide với một loại axit trong thời gian dài; đây là một hoạt động tinh vi, vì một số axit amin có thể bị phá hủy trong quá trình thủy phân và nhiều biện pháp bảo vệ khác nhau được sử dụng để ngăn ngừa và bù đắp cho điều đó.
Nhiều phương pháp khác nhau đã được phát triển để xác định từng loại axit amin. Emil Fischer là người đầu tiên chứng minh rằng este của các axit amin có thể được chưng cất và ông đã sử dụng phương pháp chưng cất phân đoạn các este được điều chế từ thủy phân protein để có được hiểu biết chính xác hơn về thành phần ban đầu của chúng. Các phương pháp khác được giới thiệu vào đầu thế kỷ XX bao gồm kết tủa chọn lọc dưới dạng muối không hòa tan, phân tích màu và xét nghiệm vi sinh, nhưng đây là những hoạt động phức tạp và tốn thời gian (6). A.J.P. Martin và R.L.M. Synge lần đầu tiên mô tả sắc ký phân vùng vào năm 1941 cho sắc ký cột (7) và sau đó là phiên bản sắc ký giấy của nó — được nhóm của Martin giới thiệu vào năm 1944 (8) — đại diện cho một bước đột phá lớn, cho phép tách và xác định đồng thời các axit amin theo cách đơn giản. Martin và Synge đã nhận được Giải Nobel Hóa học năm 1952 cho phát minh ra sắc ký phân vùng.
Sử dụng sắc ký phân chia trên các cột chứa tinh bột, vào năm 1944, Synge bắt đầu thiết lập trình tự các axit amin trong peptide, dẫn đến việc làm sáng tỏ cấu trúc của gramicidin S, một decapeptide vòng (9–12). Trong 10 năm tiếp theo, Frederick Sanger tại Đại học Cambridge (Cambridge, Vương quốc Anh) đã phát triển hơn nữa phương pháp luận của Synge, cuối cùng đã thành công trong việc thiết lập trình tự của 51 axit amin tạo nên phân tử insulin (13). Những thành tựu của ông đã được công nhận với Giải thưởng Nobel Hóa học năm 1958.
Sắc ký trao đổi ion
Trao đổi ion trong đất lần đầu tiên được mô tả vào năm 1850, nhưng trong nhiều thập kỷ, chỉ có natri aluminosilicat (“zeolit”) là vật liệu trao đổi. Do đó, khả năng sử dụng hiện tượng này bị hạn chế nghiêm trọng. Vào cuối những năm 1930 tại Đại học Columbia (New York), Harold Urey đã cố gắng tách các đồng vị liti và kali trên các cột rất dài (30–100 ft) chứa zeolit và có thể tách một phần (14). Một lĩnh vực mới trong trao đổi ion bắt đầu vào năm 1935 khi B.A. Adams và E.L. Holmes (Phòng thí nghiệm hóa học quốc gia, Teddington, Vương quốc Anh) chế tạo nhựa trao đổi ion hữu cơ tổng hợp (15). Những loại nhựa này lần đầu tiên được Olof Samuelson sử dụng tại Thụy Điển vào năm 1939 (16,17). Các loại nhựa trao đổi ion polyme tổng hợp như vậy cũng được sản xuất tại Hoa Kỳ bởi Rohm & Haas (Bridesburg, Pennsylvania) và Dow Chemical Co. (Midland, Michigan) dưới tên thương mại tương ứng là Amberlite IR-100 và Dowex 50.
Các loại nhựa tổng hợp như vậy đã được sử dụng rộng rãi trong Thế chiến II — thậm chí ở quy mô chuẩn bị — như một phần của Dự án Manhattan (phát triển bom nguyên tử) để tách các sản phẩm phân hạch và đất hiếm. Công trình này được thực hiện tại Đại học bang Iowa (Ames, Iowa) và Phòng thí nghiệm quốc gia Clinton (Oak Ridge, Tennessee) và được phân loại cao: việc công bố bị cấm trong nhiều năm. Cuối cùng, tại Cuộc họp toàn quốc mùa thu năm 1947 của Hiệp hội Hóa học Hoa Kỳ (ngày 17 tháng 9 năm 1947), một hội thảo đặc biệt đã được tổ chức, tại đó các thành viên của hai nhóm đã trình bày các báo cáo chi tiết về công trình của họ. Song song với hội thảo, Chemical & Engineering News đã công bố một báo cáo về các hoạt động được thực hiện tại Ames và Oak Ridge (18). Văn bản của 13 bài báo được trình bày tại hội thảo đã được xuất bản vào tháng 11 năm 1947 dưới dạng một ấn bản đặc biệt của Tạp chí của Hiệp hội Hóa học Hoa Kỳ. Năm 1949, tại Hội nghị Sắc ký của Hội Faraday ở London, hai trưởng nhóm, F.H. Spedding của Ames và E.R. Tompkins của Oak Ridge, đã trình bày các báo cáo chi tiết về toàn bộ dự án. Đây là cách cộng đồng khoa học biết được về khả năng sử dụng các bộ trao đổi ion hiện đại. (Một bản tóm tắt chi tiết về công trình được thực hiện như một phần của Dự án Manhattan đã được xuất bản vào năm 1999 trong một kỳ của chuyên mục “Milestones in Chromatography” của LCGC [19].)
Nghiên cứu axit amin tại Viện Rockefeller
Nghiên cứu dẫn đến sự phát triển của máy phân tích axit amin được thực hiện tại Viện nghiên cứu y khoa Rockefeller. Viện này được thành lập vào năm 1901 bởi John D. Rockefeller (1839–1937) và được xây dựng trên đất nông nghiệp dọc theo Sông Đông. Phòng thí nghiệm đầu tiên mở cửa vào năm 1904 và bệnh viện nghiên cứu bệnh tật của con người được thành lập vào năm 1910. Ngay sau đó, viện đã phát triển thành một trong những tổ chức nghiên cứu chính trong khoa học y sinh. Viện bắt đầu cấp bằng Tiến sĩ vào năm 1954, trở thành trường đại học sau đại học và cuối cùng, vào năm 1965, đổi tên thành Đại học Rockefeller. Vì câu chuyện của chúng tôi liên quan đến giai đoạn trước năm 1960, chúng tôi sẽ sử dụng tên Viện Rockefeller trong bài tường thuật của mình.
Vào tháng 3 năm 1933, Hitler và đảng Quốc xã của ông lên nắm quyền ở Đức. Một số nhà khoa học Do Thái đã sớm phải rời khỏi đất nước, nhiều người trong số họ di cư đến Hoa Kỳ. Một nhà khoa học nổi tiếng tham gia vào cuộc di cư trí tuệ này là Max Bergmann.
Max Bergmann (1884–1944) là học trò và cộng sự của Emil Fischer và đã tham gia vào nghiên cứu axit amin của ông. Ông có sự nghiệp lừng lẫy ở Đức, là người sáng lập và giám đốc Viện nghiên cứu da Kaiser Wilhelm (Dresden), nơi ông đã phát triển thành một trung tâm nghiên cứu hóa học protein hàng đầu thế giới vào những năm 1920. Ông rời Đức vào năm 1933, gia nhập Viện Rockefeller, nơi ông sớm thành lập một phòng thí nghiệm và trở thành nhân vật trung tâm trong nghiên cứu protein tại Hoa Kỳ. Bergmann đã vây quanh mình những nhà khoa học trẻ tài năng nhất, sau tiến sĩ, đưa họ trở thành những thành viên quan trọng của nhóm các nhà hóa học protein quốc tế. Hai nhân vật chủ chốt trong câu chuyện của chúng ta là William H. Stein và Stanford Moore (Hình 1).
STANFORD MOORE AND WILLIAM STEIN” by The Rockefeller Archive Center
William H. Stein (1911–1980) học tại Đại học Columbia, tốt nghiệp năm 1937 với luận án về phân tích các axit amin của protein elastin. Sau đó, ông trực tiếp đến Bergmann với tư cách là cộng sự sau tiến sĩ.
Stanford Moore (1913–1982) học tại Đại học Vanderbilt (Nashville, Tennessee) và Đại học Wisconsin (Madison), tốt nghiệp với luận án về đặc điểm của carbohydrate như các dẫn xuất benzimidazole. Thật thú vị khi lưu ý rằng trong những năm đại học, Moore cũng học các khóa kỹ thuật (trên thực tế, suy nghĩ đầu tiên của ông là chuyên ngành kỹ thuật) và với tư cách là sinh viên sau đại học trong phòng thí nghiệm của Giáo sư Karl P. Link, tại Đại học Wisconsin (Madison, Wisconsin), ông đã được đào tạo chuyên sâu về vi hóa học, bao gồm các phương pháp vi phân tích của Pregl. Sau khi tốt nghiệp năm 1939, ông gia nhập Bergmann theo lời giới thiệu của Giáo sư Link.
Có hai hướng nghiên cứu chính trong phòng thí nghiệm của Bergmann: lĩnh vực enzyme phân giải protein và hóa học cấu trúc của protein. Cả Moore và Stein đều tham gia vào lĩnh vực thứ hai và nhiệm vụ của họ là cải thiện hơn nữa các phương pháp phân đoạn axit amin theo trọng lượng thông qua sự hình thành các muối ít tan (20–22). Việc Mỹ tham chiến đã làm gián đoạn công việc của họ: nhóm của Bergmann bắt đầu làm việc cho Văn phòng Nghiên cứu và Phát triển Khoa học (OSRD), nghiên cứu các tác động sinh lý của khí mù tạt và các hợp chất liên quan, trong khi Moore rời phòng thí nghiệm và làm việc với OSRD tại Washington và tại trụ sở của Lực lượng vũ trang Hoa Kỳ ở Khu vực Thái Bình Dương. Khi chiến tranh kết thúc, Moore trở lại Viện Rockefeller. Bergmann đột ngột qua đời vào năm 1944 và nhóm trước đây của ông đã bị giải thể, nhưng giám đốc của viện đã phân bổ một phần phòng thí nghiệm của Bergmann cho Moore và Stein để phát triển chương trình nghiên cứu của riêng họ. Đây là cách mà sự hợp tác chặt chẽ của họ bắt đầu, và kéo dài trong 40 năm, cuối cùng dẫn đến phân tích định lượng các axit amin và tự động hóa của nó, và đạt đến đỉnh cao trong việc làm sáng tỏ trình tự 124 axit amin của ribonuclease, được vinh danh bằng Giải Nobel Hóa học năm 1972. Như Moore đã lưu ý, “Chúng tôi tiếp cận các vấn đề với những góc nhìn hơi khác nhau và sau đó tập trung suy nghĩ của mình vào mục tiêu chung. Nếu tôi không nghĩ ra điều gì đó, thì anh ấy có thể nghĩ ra, và ngược lại, và quá trình trao đổi ý tưởng thường xuyên này đã đẩy nhanh tiến độ nghiên cứu của chúng tôi” (23).
Khi Moore và Stein quay trở lại nghiên cứu thời bình, các số báo thời chiến của Tạp chí Hóa sinh Anh vừa mới có mặt tại Hoa Kỳ và ở đó, họ đã đọc về công trình của Synge mô tả quá trình tách các axit amin tự do bằng sắc ký phân chia trên các cột chứa tinh bột làm pha tĩnh (10,11). Họ ngay lập tức áp dụng kỹ thuật này vào các cuộc điều tra của mình, cải tiến nó hơn nữa. Họ thu thập chất thải cột thành các phần nhỏ và bằng cách thiết lập lượng axit amin trong mỗi phần, xây dựng sắc ký đồ cho thấy các đỉnh riêng biệt. Định lượng từng phần được thực hiện bằng cách điều chỉnh phản ứng màu của axit amin với ninhydrin. Lúc đầu, các phần nhỏ được thu thập thủ công, nhưng điều này quá tẻ nhạt do số lượng phần lớn. Do đó, họ đã phát triển một bộ thu thập phần rất tinh vi và hoàn toàn tự động.
Vào tháng 11 năm 1946, Viện Hàn lâm Khoa học New York đã tổ chức một hội nghị kéo dài hai ngày về sắc ký và tại đó, Moore và Stein đã trình bày một báo cáo về những kết quả ban đầu của công trình của họ. Việc công bố biên bản cuộc họp đã bị trì hoãn hơn một năm và do đó, trong văn bản in của bài thuyết trình, họ cũng có thể đưa vào mô tả chi tiết về bộ thu thập phân đoạn mới phát triển của họ (24). Tiếp theo là bốn ấn phẩm báo cáo về các kết quả tiếp theo của họ và việc xác định thành phần axit amin của β-lactoglobulin và albumin huyết thanh bò, sử dụng sắc ký phân vùng trên các cột tinh bột (25–28).
Các cột tinh bột hoạt động tốt, nhưng chúng rất chậm. Do đó, Moore và Stein đã tìm kiếm những khả năng khác. Trong khi đó, các ấn phẩm chi tiết về sắc ký trao đổi ion đã được biết đến (đã mô tả trước đó) dẫn đến công trình tiên phong của Waldo E. Cohn tại Oak Ridge (Tennessee), về việc tách các thành phần axit nucleic bằng sắc ký trao đổi ion (29,30). Các báo cáo từ Anh cũng liên quan đến sắc ký trao đổi ion để tách các axit amin trong thủy phân protein, mặc dù ở chế độ thay thế chứ không phải ở chế độ rửa giải (31). Các báo cáo này đã khởi xướng các hoạt động chuyên sâu của Moore và Stein, những người đã tham gia cùng C.H.W. Hirs (sinh năm 1923), người tốt nghiệp Đại học Columbia năm 1949. Tiến sĩ Hirs ở lại Viện Rockefeller trong 10 năm và tham gia vào phần lớn nghiên cứu về axit amin. Ông là cộng sự sau tiến sĩ trẻ đầu tiên trong nhóm của Moore và Stein. Trong 20 năm tiếp theo, 20 nhà khoa học trẻ khác đã dành một vài năm cùng họ, hợp tác nghiên cứu và tìm hiểu những điều phức tạp trong quá trình nghiên cứu protein.
Tiến sĩ Hirs đã cung cấp một câu chuyện rất sống động về nghiên cứu chuyên sâu được thực hiện bởi nhóm của Moore và Stein (32). Báo cáo đầu tiên của họ về việc sử dụng nhựa trao đổi ion để tách axit amin được công bố vào năm 1951 (33), tiếp theo là sáu bài báo nữa vào đầu những năm 1950. Khi nghiên cứu những bài báo này, người ta có thể theo dõi các cuộc điều tra cẩn thận, tỉ mỉ và có hệ thống tiếp cận mọi khía cạnh của sắc ký trao đổi ion và khả năng không chỉ phân tích axit amin định lượng mà còn phân tách ở quy mô bán chuẩn bị.
Giải Nobel Hóa học năm 1972 được trao cho Moore và Stein (cùng với C.B. Anfinsen) vì “đóng góp của họ vào việc hiểu mối liên hệ giữa cấu trúc hóa học và hoạt động xúc tác của trung tâm hoạt động của enzyme ribonuclease”. Các cuộc điều tra này bắt đầu vào năm 1954 và nhằm mục đích xác định trình tự axit amin hoàn chỉnh của phân tử. Trong quá trình nghiên cứu này, một số lượng rất lớn các phân tích thủy phân protein đã phải được thực hiện và quy trình thủ công, một phân tích hoàn chỉnh mất vài ngày, không thỏa đáng: thời gian phân tích phải được giảm xuống và cần một số loại tự động hóa. Moore luôn quan tâm đến công việc kỹ thuật — chúng ta đừng quên rằng khi còn học đại học, ông cũng đã học các khóa kỹ thuật. Vì vậy, họ quyết định nghiên cứu khả năng phát triển một máy phân tích axit amin tự động. Trong công việc này, họ có một cộng sự mới: D.H. Spackman (sinh năm 1924), người đã nhận bằng Tiến sĩ từ Đại học Utah (Provo, Utah) vào năm 1954 và chuyển từ đó đến Viện Rockefeller.
Sự phát triển diễn ra theo hai hướng: cải tiến hơn nữa quy trình tách trao đổi ion và chế tạo một thiết bị. Về mặt tách, họ đã chọn một hệ thống hai cột: một cột dài (150 cm) để tách các axit amin có tính axit và trung tính, và một cột riêng, ngắn (15 cm) cho các axit amin bazơ. Vì các axit amin bazơ vẫn nằm trên cột đầu tiên trong lần chạy chuẩn, nên cột phải được tái sinh sau mỗi lần sử dụng. Để đảm bảo khả năng hoạt động liên tục, hai cột dài đã được đưa vào hệ thống: trong khi một mẫu được phân tích trên một cột, thì cột còn lại được tái sinh. Theo cách này, khi một chu kỳ phân tích hoàn tất trên một cột, chu kỳ thứ hai đã sẵn sàng cho mẫu tiếp theo. Trong khi đó, nhựa polystyren sulfonat cải tiến đã có sẵn; họ tiếp tục phân đoạn sản phẩm thương mại để thu được kích thước hạt cắt hẹp hơn. Phương pháp này, dựa trên phương pháp tuyển nổi thủy lực, được phát triển bởi P.B. Hamilton tại Viện A.I. DuPont của Quỹ Nemours (Wilmington, Delaware) (34). Việc đóng gói cải tiến này cho phép sử dụng lưu lượng cao hơn mà không làm giảm độ phân giải.
Máy phân tích chứa ba cột trong một bộ điều nhiệt. Các bơm qua lại duy trì dòng chảy liên tục của các dung dịch đệm khác nhau được sử dụng làm chất rửa giải và để tái tạo cột. Các thành phần chính khác là các đầu dò quang được sử dụng ở 570 và 440 nm, được kết nối với một máy ghi điện thế nhiều đầu và một bình giữa các cột và các đầu dò trong đó chất thải cột được trộn liên tục với dung dịch ninhydrin. Theo cách này, các axit amin phản ứng với ninhydrin, tạo thành các hợp chất có màu. Hệ thống cũng bao gồm các thiết bị khác, chẳng hạn như máy khử khí, ống phân phối, van và đồng hồ đo. Hình 2 cho thấy sơ đồ đơn giản hóa của hệ thống. Mẫu được thêm thủ công bằng pipet vào đầu cột, nhưng từ đó trở đi, hoạt động không được giám sát. Một phân tích đầy đủ về thủy phân protein mất một ngày và một mẫu chất lỏng sinh lý phức tạp hơn mất khoảng hai ngày.
Một mô tả sơ bộ về hệ thống đã được đưa ra tại cuộc họp tháng 4 năm 1956 của Liên đoàn các Hiệp hội Sinh học Thực nghiệm Hoa Kỳ (FASEB), tại Atlantic City, New Jersey (35). Hệ thống bảng mạch thử nghiệm được xây dựng đã được sử dụng trong một số cuộc điều tra tại viện. Cuối cùng, vào ngày 28 tháng 2 năm 1958, nhóm Viện Rockefeller đã nộp hai bài báo cho Analytical Chemistry, mô tả chi tiết về việc chuẩn bị đóng gói cột, hoạt động của cột và cung cấp mô tả rất chi tiết về thiết bị và các thành phần của nó, thậm chí còn đưa ra bản vẽ kỹ thuật của máy đo quang bao gồm ba đơn vị. Hai bài báo này có tựa đề “Sắc ký axit amin trên nhựa polystyrene sunfonat” (3) và “Thiết bị ghi tự động để sử dụng trong sắc ký axit amin” (4) đã được công bố trên tạp chí số tháng 7. Chúng đại diện cho sự khởi đầu của phân tích axit amin tự động.
Sản xuất máy phân tích axit amin
Mặc dù hai bài báo đã cung cấp mô tả chi tiết về thiết bị được chế tạo trong các xưởng của Viện, nhưng có lẽ chỉ một số ít phòng thí nghiệm lớn mới có thể chế tạo được. Nhóm nghiên cứu của Viện Rockefeller đã nhận ra điều này và họ đã chuyển sang Spinco Division của Beckman, nơi mà họ đã có mối quan hệ tốt, để chuyển giao thiết kế vào sản xuất.
Specialized Instruments Company (“Spinco”) được thành lập vào năm 1946 bởi M.C. Hanafin và E.G. Pickels để thương mại hóa máy ly tâm phân tích siêu tốc được phát triển tại Viện Rockefeller dưới sự chỉ đạo của Tiến sĩ Pickels, ban đầu được chế tạo để hỗ trợ phân lập vi-rút bại liệt nguyên chất (36). Vào ngày 30 tháng 12 năm 1954, Beckman Instruments đã mua lại công ty và từ đó trở đi, công ty hoạt động với tên gọi là Spinco Division của Beckman.
Spinco đã chế tạo nguyên mẫu đầu tiên của máy phân tích axit amin — cái gọi là model MS (viết tắt của Moore và Stein) — vào mùa xuân năm 1958 (trước khi hai bài báo thực sự được công bố), nhưng ban đầu, nó có nhiều vấn đề thường gặp liên quan đến việc chuyển giao một thiết kế phức tạp từ nghiên cứu sang sản xuất. Vào thời điểm đó, Darrel Spackman rời Viện Rockefeller và gia nhập Spinco. Ông ở lại công ty trong hơn ba năm và tham gia vào việc cải tiến thiết bị; năm 1962, ông chuyển đến Đại học Washington (Seattle, Washington) và từ đó trở đi, ông có các mối quan hệ học thuật. Với sự giúp đỡ của Tiến sĩ Spackman, thiết bị đã sớm được “gỡ lỗi” và kể từ đó, việc sản xuất Máy phân tích axit amin model 120 (tên gọi cuối cùng của nó) diễn ra suôn sẻ (Hình 3). Spinco cũng duy trì liên lạc liên tục với Tiến sĩ Moore, người thường xuyên đến thăm họ (36)
Trong những năm tiếp theo, kỹ thuật và nhựa trao đổi ion đã được cải tiến hơn nữa, cho phép sử dụng một cột duy nhất (37) và giảm đáng kể thời gian phân tích. Spinco đã giới thiệu Model 120B vào năm 1963 và model 120C vào năm 1966. Hình 4 cho thấy một sắc ký đồ điển hình từ giai đoạn này: một mẫu sinh lý phức tạp hiện có thể được phân tích trong 11 giờ thay vì hai ngày như ban đầu vào năm 1958. Đối với một thủy phân protein đơn giản hơn, thời gian phân tích có thể giảm xuống còn 4 giờ hoặc thậm chí ngắn hơn. (Trong Hình 4 và 5, chúng tôi không trình bày chi tiết các điều kiện phân tích.)
Spinco đã giới thiệu thêm các mẫu máy phân tích axit amin. Ngay sau đó, các công ty sản xuất thiết bị khác cũng tham gia vào lĩnh vực này, đáng chú ý nhất là Hitachi (Nhật Bản) có máy phân tích axit amin chủ yếu dựa trên các nghiên cứu của H. Hatano (1924–1998), một giáo sư tại Đại học Kyoto (Kyoto, Nhật Bản).
Để minh họa tình trạng hiện tại của phân tích axit amin bằng sắc ký trao đổi ion, Hình 5 cho thấy sắc ký đồ điển hình của một mẫu chất lỏng sinh lý phức tạp, với tổng thời gian phân tích là 2 giờ. Sắc ký đồ này được lấy tại Phòng thí nghiệm Hóa học của Trạm Thí nghiệm Tiểu bang Missouri tại Đại học Missouri (Columbia, Missouri). Các phòng thí nghiệm có 10 máy phân tích axit amin hoàn toàn tự động Hitachi model L8800 đang hoạt động và xử lý khoảng 1300 mẫu mỗi tháng. Tùy thuộc vào độ phức tạp của mẫu, mỗi lần chạy mất từ 10 phút đến khoảng 2,5 giờ. Những dữ liệu này minh họa cách phân tích axit amin tự động tiên tiến đã trở nên như thế nào.
Các phương pháp khác
Ngày nay, sắc ký trao đổi ion không phải là phương pháp duy nhất được sử dụng để xác định axit amin: nó được bổ sung bằng sắc ký khí (GC), LC và điện di mao quản (CE). Để kết thúc câu chuyện của chúng tôi, một vài lời về những phát triển này được đưa ra ở đây.
Việc sử dụng GC để phân tích axit amin trở nên khả thi nhờ sự phát triển của các phương pháp để chuẩn bị các dẫn xuất dễ bay hơi ổn định, đáng chú ý nhất là các este N-trifluoroacetyl n-butyl. Tại Đại học Missouri, Gehrke và các cộng sự, trong một thập kỷ nghiên cứu tỉ mỉ, đã thiết lập các phương pháp tối ưu để xử lý mẫu và hình thành dẫn xuất, cũng như các điều kiện GC tối ưu cho phép phân tích thường quy (38,39). Công trình này đã đạt đến đỉnh cao trong quá trình họ điều tra các mẫu mặt trăng từ các sứ mệnh Apollo 11 đến 17, để tìm kiếm sự hiện diện có thể có của axit amin (40,41).
Trong LC, bước quan trọng trong xử lý mẫu liên quan đến việc chuẩn bị các dẫn xuất ít phân cực hơn cho phép sử dụng sắc ký pha đảo ngược và tăng cường khả năng phát hiện UV, huỳnh quang và khối phổ (MS). Gần đây hơn, các phương pháp phân tích LC các axit amin chưa được phân tích, với phát hiện MS, cũng đã được phát triển. Ngày nay, các hệ thống LC tự động để phân tích axit amin có sẵn từ một số công ty thiết bị.
Việc sử dụng CE để phân tích axit amin còn khá mới và vẫn đang phát triển. CE rất dễ thích nghi với chất lỏng sinh học và ít hoặc thậm chí không cần xử lý mẫu. Có thể sử dụng phương pháp hấp thụ tia cực tím, huỳnh quang và phát hiện điện hóa cũng như kết hợp với MS.
Tài liệu về phân tích axit amin rất phong phú và chúng tôi chỉ tham khảo ở đây một vài bài báo tổng quan hữu ích gần đây (42,43), cũng như hai chuyên khảo chung về tình trạng nghệ thuật của các kỹ thuật phân tích khác nhau (44,45).
Với công trình tiên phong của mình vào những năm 1950, Moore và Stein đã mở ra một lĩnh vực hoàn toàn mới cho các nhà hóa sinh và có thể coi đây là một trong những cột mốc quan trọng trong quá trình phát triển sắc ký kéo dài hàng thế kỷ.
Lời cảm ơn
Các hoạt động của Moore và Stein dẫn đến máy phân tích axit amin đã được ghi lại trong nhiều nguồn tài liệu, chẳng hạn như tự truyện của họ (46), bài giảng Nobel của họ và tài liệu liên quan (47), cũng như hồi ức của C.H.W. Hirs (32) và M.J. Gordon (36), và báo cáo của chúng tôi dựa trên các nguồn này. Chúng tôi muốn bày tỏ lòng biết ơn đặc biệt đến cô Pat Ashton của Triển lãm Di sản tại Beckman-Coulter, Fullerton, California, vì thông tin về Spinco và các hoạt động của họ liên quan đến máy phân tích axit amin, và vì những bức ảnh được sử dụng trong Hình 3 và 4. Tiến sĩ Thomas P. Mawhinney, Trạm Thí nghiệm Tiểu bang Missouri, đã vui lòng cung cấp cho chúng tôi sắc ký đồ được hiển thị trong Hình 5. Chúng tôi cũng nên ghi nhận sự giúp đỡ của Tiến sĩ Robert L. Wixom, Columbia, Missouri, liên quan đến thông tin về nghiên cứu axit amin ban đầu và của cô Rebecca Graves, thủ thư dịch vụ giáo dục tại Thư viện Khoa học Sức khỏe, Đại học Missouri tại Columbia, trong việc tìm kiếm tài liệu.
Tài liệu tham khảo về các ấn phẩm của Moore và Stein cùng các cộng sự được đưa ra ở đây để ghi lại tiến trình công trình của họ dẫn đến máy phân tích axit amin. Chúng tôi không có ý định trình bày một danh mục tài liệu tham khảo đầy đủ về các ấn phẩm của họ hoặc cung cấp bản đánh giá về công trình của các nhà khoa học khác đã đóng góp vào các cuộc điều tra về axit amin và protein cũng như vào việc phát triển các phương pháp phân tích để phân tích axit amin.
Charles W. Gehrke là giáo sư danh dự về hóa sinh tại Đại học Missouri, Columbia. Ông đã gắn bó với trường trong 37 năm và cũng là người đứng đầu Phòng thí nghiệm hóa học của Trạm thí nghiệm tiểu bang Missouri. Ông là người tiên phong trong việc phát triển phương pháp phân tích axit amin bằng GC và từng là đồng điều tra viên với Tiến sĩ Ponnamperuma của NASA về các phân tử sự sống trong đá Mặt trăng do tàu vũ trụ Apollo 11–17 mang về. Ông là người nhận được nhiều giải thưởng, trong số đó có Giải thưởng quốc gia về sắc ký và Khoa học phân tách của Hiệp hội hóa học Hoa Kỳ.
Leslie S. Ettre Từ năm 1988 đến năm 2004, biên tập viên “Milestones in Chromatography” Leslie S. Ettre đã gắn bó với Khoa Kỹ thuật hóa học của Đại học Yale (New Haven, Connecticut), đầu tiên là giáo sư thỉnh giảng và sau đó là nghiên cứu viên. Trước đó, ông đã làm việc tại Perkin-Elmer Corporation trong 30 năm. Hiện ông là thành viên ban cố vấn biên tập của LCGC.
